近日，从熙宁生物分析实验室传来好消息，经过3个多月的努力。恒瑞医药biomarker团队和熙宁生物项目团队（以下简称恒瑞和熙宁团队），成功开发出基于流式细胞术检测ERK磷酸化蛋白的方法，该方法将作为重要的PD指标支持恒瑞医药SHP2抑制剂的临床开发。

一、       SHP2的结构和功能

SHP2（PTPN11基因编码）是一个由593个氨基酸组成的经典非受体蛋白酪氨酸磷酸酶，它包含两个Src同源2结构域（N-SH2和C-SH2）和一个PTP（蛋白质酪氨酸磷酸酶）催化域，是PTP家族中唯一一个原癌基因。

二、       SHP2与肿瘤

SHP2在大多数组织中广泛表达，并在各种细胞信号事件中起调节作用，对于促有丝分裂、代谢控制、转录调节、细胞迁移等多种细胞功能非常重要。SHP2是人类中经过充分验证的PTP癌蛋白，并且正在成为治疗癌症的重要靶标。PTPN11的功能获得性突变见于约50％的发育异常Noonan综合征（NS）病例中和超过30％的最常见的小儿白血病；种系PTPN11突变在90％的LEOPARD综合征（LS）患者中被发现；突变还发生在散发性实体瘤中，包括肺癌，结肠癌，神经母细胞瘤和黑色素瘤（下图A）。根据《癌症体细胞突变目录》（COSMIC）中精选的数据，肿瘤样本中有75.5％携带PTPN11错义突变，并在N-SH2和PTP域中更频繁地发生（下图B）。

在实体瘤中很少发现SHP2突变，而SHP2的过度激活起着至关重要的致病作用，因此通过阻断或抑制SHP2的通路激活可以明显改善肿瘤治疗，其中包括（1）SHP2敲除可显著抑制肿瘤细胞的维持和发展；（2）抑制SHP2可以抑制RTK驱动的癌细胞（如EGFRL858R驱动的肺腺癌，BRAF突变的结肠癌和KRAS突变的乳腺癌）的生长并增强RTK抑制剂的治疗效果；（3）阻断SHP2，诱导肿瘤衰老，从而触发免疫系统清除癌细胞。

三、       SHP2信号传导通路

    SHP2位于细胞质中，可被RTK募集以诱导细胞信号传导，并参与多个细胞内致癌信号传导级联反应，例如Jak / STAT，PI3K / AKT，RAS / Raf / MAPK，PD-1 / PD-L1 ，以及mTOR途径。其中将胞外信号传导到核内的关键GTP酶RAS，被SHP2调节（衔接子/支架蛋白中的酪氨酸去磷酸化）成为活化状态的GTP结合模式发挥致癌作用；另一方面，在获得性耐药中SHP2对RAS信号激活促进了信号通路的代偿性激活（如MEK的负反馈调节激活RTK，活化SHP2从而激活下游通路），在这种情况下，对SHP2的抑制作用可以消除RAS / Raf / ERK途径的重新激活，并代表一种潜在的治疗策略，作为一种新的解决RTK耐药问题的策略（下图C）。

另一方面，在免疫微环境中， PD-1通过ITIM / ITSM结构域募集SHP2可以阻止T细胞通过TCR和共刺激CD28激活T细胞活化信号，从而抑制下游通路以降低肿瘤负荷，包括PI3K / AKT，RAS / Raf和PLCγ。总的来说，SHP2的抑制作用通过降低细胞因子表达和T细胞活化、增殖、存活而抑制T细胞依赖性免疫反应（下图D）。因此可以通过抑制SHP2从而恢复Th1免疫功能（主要介导细胞免疫应答）和活化T细胞，进而激活肿瘤微环境中的免疫应答，鉴于抗PD-1 / PD-L1治疗药物的成功， SHP2抑制剂与免疫检查点抑制剂联合用于癌症免疫治疗具有潜在可能性。

四、       SHP2抑制——“一石多鸟”的肿瘤治疗策略

SHP2被认为是一个理想的癌症干预靶标，这是因为SHP2是多条激活RAS信号通路的共有节点，激活RAS对癌细胞的生长和存活都非常重要，因此抑制SHP可在抑制癌细胞生长的同时，解除免疫细胞的免疫抑制，增强抗肿瘤免疫活性，是一种“一石多鸟”的肿瘤治疗策略。

五、       SHP2靶点抑制剂在研药物

全球 SHP2 抑制剂尚无产品上市，进入临床阶段开发的品种较少。目前，进入临床的 SHP2 抑制剂主要包括诺华的 TNO155 （II 期），Revolution Medicines / 赛诺菲共同研发 RMC-4630（II 期）、Relay Therapeutics 公司开发的 RLY-1971（I 期），Navire Pharma Inc. 公司开发的 BBP-398（I 期），Erasca公司开发的ERAS-601（I 期），以及国内药企北京加科思开发的 JAB-3068（IIa 期）、JAB-3312（I 期）、诺诚健华的 ICP-189、奕拓医药的ET0038、圣和药业的SH3809等。相信随着研究的深入，会有越来越多的医药企业加入到SHP2的研发行列中，SHP2靶点将有望成为小分子药物的中PD-1。

六、       SHP2 抑制剂临床PD指标

通过查阅https://clinicaltrials.gov/网站上个SHP2抑制剂的公开信息，发现主要的PD指标如下：

表1，SHP2抑制剂临床开发中主要的PD指标

七、       恒瑞和熙宁团队开发的基于流式细胞术的pERK检测方法

在方法开发进行前，恒瑞与熙宁团队就进行了多轮的讨论。讨论主要针对以下几个方面展开：

1.       能否使用采集后的外周血直接进行pERK的检测，比较给药前后pERK水平的变化，进行PD的评估？

2.       如果不能直接检测，可以使用的刺激剂有哪些？

3.       需要检测哪些细胞亚群上pERK 水平的变化？

结合SHP2的信号通路，以及恒瑞和熙宁团队丰富的磷酸化蛋白检测经验。经过初期的实验测试，团队证明在健康人外周血或者PBMC中，pERK的水平很低，所以无法通过比较给药前pERK水平与给药后pERK水平，确认SHP2蛋白的抑制效果。

通过查阅大量文献和数次讨论，恒瑞biomarker和熙宁团队选择并测试了20余种不同的重组蛋白、抗体、小分子刺激剂等，最终找到了合适的刺激剂。

从表1可以看出，加入不同浓度的刺激剂，在没有SHP2抑制剂的情况下，pERK信号值变化明显，而加入高浓度的SHP2抑制剂，pERK信号值基本无变化。从表2可以看出，加入高浓度的抑制剂，pERK信号值很低，而随着SHP2抑制剂浓度的降低，pERK信号值逐渐升高。通过以上两组数据，我们可以判断，我们筛选到合适的刺激剂，可以刺激特定细胞亚群的pERK水平增加，而该pERK的增加，可以被SHP2抑制剂特异性的抑制。

表1，不同的刺激剂浓度下，pERK信号值的变化

表2，同一刺激剂浓度，不同浓度的SHP2抑制剂对于pERK信号的抑制

综上，恒瑞和熙宁团队经过不懈的努力，成功开发出基于流式细胞术的pERK检测方法用于支持SHP2抑制剂项目的临床PD检测，该方法可以检测外周血中某特定细胞亚群中pERK水平的变化。具有灵敏度高，特异性好，操作简便，费用较低等很多优点。

恒瑞医药作为国内医药产业的领头羊，已经加入SHP2抑制剂的赛道中。据悉，恒瑞医药SHP2抑制剂产品已经收到国家药品监督管理局核准签发的《药物临床试验批准通知书》，将于近期开展临床试验。相信，因为恒瑞和熙宁生物开发出合适的PD评价指标，会使该药物的临床评价更加的高效，进而加快临床的进度，实现该药物早日上市，造福广大病患。

参考信息：

下一个重磅炸弹：SHP2抑制剂研发进展。

SHP2抑制剂：一遇风云便化龙。

中国领跑，大厂布局，一文揭开肿瘤免疫新靶点SHP2的“庐山真面目”。

SHP2别构抑制剂：小分子药物“复兴”？。

奕拓医药SHP2变构抑制剂获FDA批准IND 国内还有这些药企在布局。

关于恒瑞医药

恒瑞医药是一家从事医药创新和高品质药品研发、生产及推广的医药健康企业，创建于1970年，2000年在上海证券交易所上市，是国内股票市值最大的制药上市企业。公司坚持实施“科技创新”战略，近年来每年投入销售额15％左右的研发资金，在美国、欧洲、日本和中国多地建有研发中心或分支机构，全球员工24000人，其中在欧美的海外员工200多人。公司是国家“重大新药创制”专项孵化器基地、国家抗肿瘤药技术创新产学研联盟牵头单位、国内最具创新能力的制药企业之一，建有国家靶向药物工程技术研究中心、国家博士后科研工作站。

公司本着“科技为本，为人类创造健康”的核心理念，致力于为全球患者提供优质可负担的医药资源。公司抗肿瘤药、手术麻醉类用药、特色输液、造影剂市场份额在国内市场名列前茅，也是唯一一家将注射剂规模化销往欧美日市场的中国制药企业。

关于熙宁生物

熙宁生物是一家专业的符合国际GLP&GCP质量管理规范的大分子生物分析实验室，为国内外生物医药公司提供临床和临床前大分子生物分析的一站式服务，包括抗体制备，样本采集包及实验室手册，符合法规要求的分析方法的开发和验证，以及样本分析。包含药代动力学（PK），药效动力学（PD），抗药抗体（ADA），中和抗体（NAb），生物标志物（Biomarker）受体占位（RO），以及基于流式细胞术（FACS）和荧光定量PCR （qPCR）平台的针对新型细胞治疗（CAR-T ,CAR-NK)和基因治疗药物的PK, PD分析服务。     公司领导团队平均有近20年的专业经验，多位在国际知名药企和CRO工作多年的海归博士、大分子生物分析专家、中美多个行业协会的常任理事，曾参与《中国药典2015版》“生物样品分析方法验证指导原则”，及多个国际上行业白皮书的撰写，支持过200+全球多中心临床试验，100+各类大分子产品。为多个国际重磅级药物提供上市审批数据支持。 公司在宁波（宁波熙宁检测技术有限公司）、上海（上海精翰生物科技有限公司）、美国新泽西（Accurant Bio)都建有实验室。和国内外超五十家一线药企和生物科技公司建立了项目合作，涵盖肿瘤免疫，自身免疫，降糖等多个热门治疗领域，包含多肽，重组蛋白，融合蛋白，单克隆抗体，双特异性抗体，纳米抗体，ADC和Car-T等各类生物大分子。